Zakład Chorób Świń

Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy w Puławach

Konstrukcja rekombinowanego szczepu wirusa afrykańskiego pomoru świń (ASFV) przy użyciu techniki CRISPR/Cas9 oraz określenie jego właściwości biologicznych in vitro i na modelu świń.

UMO-2016/21/D/NZ6/0097

 

Kierownik Projektu: dr hab.  Grzegorz Woźniakowski,  prof. nadzwyczajny

Rozpoczęcie: 2017 r.

Finansowanie: NArodowe Centrum Nauki (NCN)

 

 

Badania realizowane w ramach projektu finansowanego przez Narodowego Centrum Nauki (NCN), nad opracowaniem prototypu delecyjnego szczepu wirusa ASF; wstępne badania nad możliwością skonstruowania skutecznej szczepionki przeciw ASF. W odporności komórkowej przeciwko ASFV zasadnicze znaczenie mają limfocyty T i komórki NK (natural killers), czyli naturalni zabójcy, jak również komórki T CD8. Wirusowe systemy unikania odpowiedzi immunologicznej gospodarza polegają m.in. na synergistycznym działaniu białek kodowanych przez regiony A238L, EP402R i 9GL. Wymieniony projekt ma na celu zbadanie właściwości biologicznych rekombinowanego szczepu ASFV pozbawionego genów A238L, EP402R i 9GL. W ramach podjętych w PIWet-PIB badań zastosowano innowacyjną technikę CRISPR/Cas9 (regularnie zgrupowanych i oddzielonych krótkich sekwencji palindromowych), stanowiącą obecnie najbardziej nowoczesne i efektywne narzędzie inżynierii genetycznej (Ryc.2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ryc.2 Kompleks enzymu Cas9 (nukleazy) oraz matrycy gRNA specyficznej dla wybranego regionu wirusa afrykańskiego pomoru świń (ASFV). Na schemacie zaznaczono region PAM sąsiadujący z regionem przecięcia DNA i utworzenia pęknięcia obu nici (DSB – double strand breaks)

 

 

 

Etap I. W celu modyfikacji genów A238L, EP402R i 9GL zaprojektowano matrycowe odcinki gRNA dla endonukleazy Cas9 związanej z systemem CRISPR. Dokładnie zaprojektowane matryce gRNA pozwoliły na przecięcie fragmentów DNA w wyznaczonych regionach genomu ASFV a następnie ponowne połączenie nici DNA dzięki homologicznym systemom naprawczym (Ryc.3).

 

 

       
   
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

(A)                                                                                                                                    (B)

 

 

Ryc.3. (A). Projektowanie specyficznych gRNA dla genów A238L, EP402R oraz 9GL dla metody CRISPR/Cas9. (B) PCR dla specyficznych gRNA w komorkach hodowli makrofagów alweolarnych świń (PAMs), oraz komórek WSL – śledziony dzika udostępnionych dzięki uprzejmości Instytutu F. Loefflera na wyspie Riems w Niemczech.

 

 

Etap II. Obecnie otrzymany rekombinowany szczep ASFV podany jest analizom sekwencjonowania następnej generacji (NGS). Właściwości rekombinowanego szczepu ASFV są również badane w hodowlach komórek śledziony dzika (WSL) (Ryc.4). Obecnie na końcowym etapie prowadzone są badania mające na celu weryfikację wprowadzonych mutacji punktowych w obrębie wybranych regionów genomu mających znaczenie w unikaniu przez wirus odpowiedzi immunologicznej zakażonego gospodarza.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ryc.4. Komórki WSL – śledziony dzika zakażone rekombinowanym szczepem ASFV 4 dni po zakażeniu. Widoczna apoptoza zakażonych komórek.

 

 

Etap III. W końcowym etapie projektu - w 2019 roku planowane jest przeprowadzenie badań z użyciem 30 świń o znanym statusie immunologicznym w pomieszczeniach dla zwierząt klasy PCL3+ PIWet-PIB o wysokich standardach bioasekuracji. Uzyskane wyniki będą analizowane statystycznie przy użyciu oprogramowania Statistica PL i pozwolą na określenie wpływu wprowadzenia indukowanych mutacji na replikację oraz wirulencję ASFV. Uzyskane wyniki badań będą publikowane w renomowanych czasopismach zagranicznych o tematyce wirusologicznej oraz dotyczących chorób zakaźnych o wysokim znaczeniu ekonomicznym. Planowane jest również przedstawienie wyników badań podczas konferencji krajowych i zagranicznych poświęconej tematyce chorób świń. Oprócz poznawczej wartości planowanych badań ich wyniki pozwolą na wskazanie kierunku dalszych eksperymentów do otrzymania potencjalnych kandydatów do opracowania skutecznej szczepionki przeciwko ASF.

Skontaktuj się z nami

sekretariat: anna.rakowska@piwet.pulawy.pl

tel. (81) 889 31 20

fax. (81) 889 33 46

 

 

 

 

 

Zakład Chorób Świń

Państwowy Instytut Weterynaryjny-Państwowy Instytut Badawczy

Al. Partyzantów 57

24-100 Puławy

Lorem ipsum dolor

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. In facilisis lorem commodo, tincidunt tortor luctus, porttitor neque. Fusce nisl massa, lobortis at diam vel

Skontaktuj się z nami

mail: kontakt@kontakt.pl

tel. 601 234 567 

Ul. Uliczna 25

Warszawa 02-200